A növények felületén számos gomba, vírus, patogén és szaprofiton baktérium telepedik meg, így a növények folyamatosan ki vannak téve a fertôzésnek. A patogén baktérium a fogékony gazdanövény sejtközötti járatában szaporodik, és betegséget okoz. Nem csak a növényvédô szerek védik meg azonban a növényeket a betolakodóktól, hanem a növény sejtjeinek aktív és autonóm önvédelme is. Régóta ismert, hogy a kórokozónak a nem-gazdanövénnyel vagy az ellenálló, rezisztens gazdanövénnyel való találkozása esetén ún. inkompatibilis kapcsolat, hiperszenzitív reakció (HR) alakul ki (Klement és mtsai 1964). A HR részét képezô gyors növényi sejthalál elpusztítja az érintett sejtek környezetében lévô mikroorganizmusokat és magát a növényi sejtet is. Ez a természetben egy- vagy néhány sejtes elhalások formájában mutatkozik, amit gyakran csak mikroszkóp segítségével érzékelhetünk.
A szaprofiton baktériumok sem tudnak elszaporodni és betegséget okozni az egészséges növényben, annak ellenére, hogy a növény sejtközötti járataiból nyert folyadék ideális tápközeg számukra. Ez „az általános, nem specifikus indukált rezisztenciának” köszönhetô (Sequeira 1983). Az általános védekezés során dohányban egy korai (Early Basal Resistance, EBR; korábbi elnevezés: korai indukált rezisztencia – Early Induced Resistance, EIR) (Burgyán és Klement 1979) és egy késôi (Late Basal Resistance, LBR; korábbi elnevezés: késôi indukált rezisztencia – Late Induced Lesistance, LIR) (Lovrekovich és Farkas 1965, Sequeira és Hill 1974) immunválasz figyelhetô meg. Az EBR gyorsan, hatékonyan lokalizálja és fegyverzi le a baktériumot már annak behatolásakor, de elsôsorban gyorsasága miatt a védekezés elsô vonala.
Nem csak a patogén és szaprofiton baktériumokat, hanem a patogének HR okozásra képtelen hrp mutánsait és a hôvel elölt baktériumsejtek közös felületi molekuláris mintázatát (struktúráját) is felismeri a növényi sejt, és tünetmentesen lezajló helyi, vagyis csak az érintett sejtre vagy sejtekre korlátozódó EBR-t használ ellenük (Klement és mtsai 1999). Az elsô fertôzést követô 24–48. órára kialalkul az LBR, ami a késôbbi fertôzésektôl is megvédi a növényt (Lovrekovich és Farkas 1965). Baktériummal történô fertôzést követôen az EBR már a 2–6. órától mûködik legalább 24 órán keresztül.
Gátolja nem csak a baktériumok növénybeni szaporodását, hanem a HR-ért és patogenitásért felelôs ún. hrp gének aktivitását is (Bozsó és mtsai 1999, Ott 2002).
Állatokban az általános vagy veleszületett immunitás elicitoraként olyan általános baktériumfelületi molekulák ismertek, mint a flagellin (Aderem és Ulevitch 2000) – a baktériumok mozgásszervének, a flagellumnak (ostornak) a fehérje-alkotórésze – és a lipopoliszacharid – a Gram-negatív baktériumok sejtfalának egyik alkotóeleme (Medzhitov és Janeway 1997). Az állatok veleszületett immunitása és a növények általános védekezési mechanizmusa között számos hasonlóság fedezhetô fel (Szatmári és Klement 2004; Klement és Szatmári 2004). A legtöbb közös vonás e két különbözô élôlénycsoport és az általuk való idegen felismerésben található. Mára bebizonyosodott, hogy nem csak az állatok, hanem a növények is felismerik a baktériumok flagellinjét (Zipfel és mtsai 2004) és az LPS-t (Dow és mtsai 2000).
LPS-t a Gram pozitív-baktériumok sejtfala nem tartalmaz, és nem minden Gram-pozitív baktériumnak van flagelluma. Számos növényi fehérjérôl tudunk, amelyek valamilyen kórokozó fertôzésének hatására termelôdnek.
Ezek a PR, vagyis a patogenezishez kapcsolt fehérjék. A dohány PR fehérjéi között több kitináz is található. A PR kitinázok azonban nem csak különbözô kórokozókra reagáló növényben vannak jelen, hanem más hatásokra is termelôdnek, többek között sebzésre, abiotikus stresszekre, valamint különbözô kemikáliákra stb. is (1. táblázat).
Baktériumos fertôzéskor is megjelennek a kitinázok (2. táblázat), ami azért érdekes, mivel a baktériumokban nincs kitin (N-acetil-glükózamin egységekbôl felépülô poliszacharid), a kitináz enzimek természetes szubsztrátja. Munkánk során mi is kitinázokat találtunk a dohány sejtközötti folyadékában baktériumos fertôzés esetén. A kitinázok lehetséges funkcióit ismerve, az EBR hatásmechanizmusában fontos szerepet tölthetnek be. Az EBR-hez kapcsolt kitinázoknak például azért lehet szerepük az EBR-ben, mert ismertek olyan ún. lizozim aktivitású kitinázok, amelyek szubsztrátja a baktériumok sejtfalában található peptidoglükán (Roberts és Selitrennikoff 1988).
A peptidoglükán, hasonlóan a kitinhez, N-acetilglükózaminegységekbôl valamint N-acetil-muraminsavból és ahhoz kapcsolódó rövid peptidláncból áll. Így a lizozim aktivitású kitinázok, a β-1,4 kötéseknél hasítva a láncot, képesek elbontani a baktériumok sejtfalát.
A növénypatogén gombák által indukált védekezési mechanizmusban már ismert a kitinázok szerepe. Kísérleteink elsôdleges célja ezért az, hogy tisztázzuk a kitinázok szerepét a növények korai általános védekezési mechanizmusában, valamint a növények baktériumok elleni védekezésében.
Anyag és módszer
Növények
Dohány- (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun nn) növényeket üvegházban neveltük. A 4–8 leveles fejlettségû növényeket klímakamrákba tettük 1 nappal a kísérlet kezdete elôtt. A klímakamrában 20–25 °C, 50–60%-os páratartalom és napi 16 óra 200 µmol m–2 s–1 fényerôsségû megvilágítás volt.
Kezelés baktériumokkal
A kísérletekeben használt baktériumokat – Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola (a továbbiakban P. phaseolicola), Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syringae pv. syringae 61 hrpJ, Micrococcus lisodeicticus, Pseudomonas syringae pv. coriandricola, Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (patogenitását vesztett mutáns), Pseudomonas tabaci – King’s medium B (King és mtsai 1954) folyékony táptalajon, 25 °C-on szaporítottuk.
Élô baktériumokkal való kezelésen kívül hôvel elölt baktériumokat is használtunk (P. tabaci, P. phaseolicola esetében). Az elölés elôtt a sejtsûrûséget 109 sejt/ml-re állítottuk be. A szaporodás kései logaritmikus fázisában lévô baktériumsejteket centrifugáltuk, a folyékony tápoldat leöntése után vízzel mostuk, majd 70 °C-os vízfürdôben 13 percig inkubáltuk. Az elölés után hígítással állítottunk be 5 × 108 sejt/ml denzitást.
Az élô vagy elölt baktériumszuszpenziót az erek közötti levéllemez-területekbe fecskendeztük, steril orvosi fecskendôvel és 26-os méretû tûvel (Klement 1990).
Sejtközötti folyadék kinyerése
A sejtközötti folyadékban található fehérjék vizsgálata azért fontos, mert a növénykórokozó baktériumok a sejtközötti járatokban szaporodnak, sosem jutnak be az élô növényi sejtbe, s csak a növényi sejtfallal lépnek közvetlen érintkezésbe.
Így elôfordulhatnak olyan fehérjék, amelyek a sejtfalban vagy a sejtközötti térbe kijutva hatnak a baktériumokra. Módszerünk Klement (1965) kinyerési módszerén alapult, Ott Péter G. módosításai alapján. A dohánylevélbôl a kezelt érközöket kivágtuk és desztillált vízben a vágási felületeket a sejttörmelékektôl lemostuk. A mosott levélérközöket elôzôleg gáztalanított desztillált vízbe merítettük, majd a leveleket vákuum alá helyezve a sejtközötti járatokból a levegô eltávozott. 1–2 perc után lassan megszüntettük a vákuumot, és így a levelek sejtközötti tere egyenletesen megtelt vízzel. A levelek felületérôl szûrôpapírral leitattuk a vizet. Az azonos kezelésû levélérközökbôl 1–3 db-ot 30 ml-es centrifugacsövekbe helyeztük, a csô fala felé a levél színével. 2–3 érköz centrifugálása esetén a levéldarabokat a centrifugacsô belsô oldalához ragasztószalaggal is rögzítettük biztosabb tapadás végett. A centrifugacsöveket 6 × 30 ml-es szögrotorban, 1000 g viszonylagos nehézségi gyorsulással 15 percig centrifugáltuk, 4 °C-on. A centrifugális erô hatására a sejtközötti járatokból a nyitott légzônyílásokon keresztül eltávozó és a centrifugacsô aljában összegyûlt sejtközötti folyadékot –70 °C-on tároltuk a felhasználásig.
A sejtközötti folyadék fehérjéinek poliakrilamidgél-elektroforézise
A fehérjék szétválasztására nagy pH-jú, nem-disszociáló (natív), megszakított Ornstein–Davis-pufferrendszert (Ornstein és Davis 1964) használtunk, melyben az elválasztó gél porozitása a futás irányába csökkent (poliakrilamid grádiense 10–20%). Kisméretû 8 × 7,3 × 0,1 cm-es géleken történt az elválasztás. A géleket ezüstfestéssel festettük meg R. Tchernuschko, Göttingen, PhD (1995) disszertációja alapján.
A tömegspektrometriás analízisre küldött géleket módosított Coomassie-festéssel (Rosenfeld és mtsai 1992) festettük meg.
Kitinázaktivitás-teszt Glikol-kitozánból több lépcsôn keresztül glikol-kitint állítottunk elô. A kitinázaktivitásteszt során az elôbb leírt módon futtatott gélek felületére a 0,04% glikol-kitint tartalmazó fedôgélt szorosan ráhelyeztük. Az egymáson való elmozdulásukat kerülve 2 órán keresztül, 37 °C-on inkubáltuk a géleket, megóva a kiszáradástól. Az inkubációs idô letelte után a fedôgélt fluoreszcens festékkel (Fluorescent Brightener 28, Sigma) festettük meg. Majd UV fénnyel megvilágítva, azon fehérjék helyén, amelyeknek kitináz-aktivitásuk van, nem fluoreszkáló foltokat figyelhettünk meg (Trudel és Asselin 1989).
Tömegspekrometriás meghatározás
Gélben emésztés: A géleket 25 mM NH4HCO3/50% acetonitril oldattal mostuk a sók és a Coomassie Brilliant Blue festék eltávolítása végett. A diszulfid-hidakat ditiotreitollal redukáltuk, majd a szabad szulfhidril-csoportokat jódacetamiddal alkiláltuk. Az emésztést Promega oldallánc-védett tripszinnel végeztük 25 mM NH4HCO3 -oldatban (pH 8) 37 °C-on 4 órán át. A triptikus peptideket 2% hangyasav/ 50% acetonitril oldattal extraháltuk, majd C18 Zip-tip-en (Millipore) sótalanítottuk.
Tömegspektrometriás analízis: A frakcionálatlan minták MS (Mass Spectrometry) analízisét Bruker Reflex III MALDI-TOF tömegspektrométeren végeztük. 2,5-dihidroxi-benzoesavat használtunk mátrixnak. Belsô kalibrálásra tripszinautolízis-termékek szolgáltak: m/z 842,51 és 2211,10. Néhány kiválasztott ionról 10–12 lépésben MS-MS (PSD, post source decay) spektrumot vettünk fel, minden lépésnél 25%-kal csökkentve a reflektronfeszültséget. A kapott peptidtömegekkel MS-Fit, a PSD adatokkal MS-Tag, a PSD adatokból de novo meghatározott szekvenciákkal pedig MS-Pattern lekeresést végeztünk az NCBI adatbázisában a Protein Prospector (https://prospector.ucsf.edu/) programcsomag segítségével.
Az EBR tüneti kimutatása
Mivel az EBR tünetmentes, ezért jelenlétét csak közvetett módszerrel lehet kimutatni. Ilyenkor EBR-t indukáló kezelésként hôvel elölt, babpatogén Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicolát injektáltunk a dohánylevélbe. Az EBR-induktor bejuttatása után élô P. s. pv. phaseolicolával felülfertôztük az elôkezelt részt. Az élô babkórokozó inkompatibilis a dohányban, ezért HR-t okozott, melynek a levélszövet elhalása volt a látható jele. Ha az elôkezeléskor bejuttatott baktérium vagy más elicitor indukálta az EBR-t, akkor a HR nem jelenik meg (Klement és mtsai 1999).
Eredmények és megvitatás
Tömegspektrometriás analízis
A gélelektroforézissel elválasztott két sáv triptikus emésztményét frakcionálás nélkül vizsgáltuk MALDI-TOF tömegspektrometriával.
Mindkét emésztményben kb. 20 peptidet detektáltunk, amelyek 80%-a a két mintában megegyezett, ebbôl arra következtettünk, hogy azonos vagy igen hasonló fehérjékkel állunk szemben. A mért peptidtömegekbôl nem tudtunk fehérjét azonosítani, ezért PSD spektrumot vettünk fel a hat legintenzívebb peptidrôl: MH+= 779,4; 1588,7; 1748,8; 1899,9; 2464,2 és 2649,2. Az MH+= 779,4 és 1588,7 tömegû peptidek PSD-spektrumának manuális szekvenálása a következô aminosavsorrendeket eredményezte: DAVI/LSFK és ....PDI/LVAR. (Izomer Ile / Leu között nem tudunk különbséget tenni.)
Ezek a szekvenciák MS-Pattern lekeresés alapján egy 26 kDa-os bab kitináz (NCBI#10120702) [144–150] és [138–143] szakaszainak feleltek meg. Ezen kívül az MH+= 1748,8 tömegû peptid PSD-spektruma MS-Tag lekeresés alapján egy rizs kitináz (NCBI# 7435372) triptikus peptidjére illett: GPLQISWNFNYGPAGK.
Az aláhúzott aminosav-szekvenciát a spektrumban detektált N- és C-terminális fragmens ionok egyértelmûen alátámasztják. Mindent egybevéve úgy tûnik, hogy egy ez idáig még le nem írt dohány kitinázt találtunk a mintákban.
Kitinázok indukálása különbözô baktériumokkal
Az EBR induktor bejuttatása után már 6 órával a sejtközötti folyadékban két új, kitinázként azonosított fehérje megjelenését figyelhettük meg. E két fehérje idôbeli megjelenése és lefutása jól korrelált az EBR-rel.
Élô, nem-virulens P. coriandricola, a patogenitásától megfosztott A. tumefaciens mutáns, E. coli, a szaprofiton P. fluorescens, a HR okozásra képtelen P. syringae 61 hrpJ mutáns és hôvel elölt dohánykórokozó P. tabaci egyaránt indukálta a kitinázokat (1. ábra). Megállapítható volt, hogy minden baktérium, amely EBR-t indukál, egyben indukálta a kitinázokat is a dohánylevelekben.
Az 1. ábrán látható, hogy a hôvel elölt kompatibilis P. tabaci baktérium egyaránt indukálja a kitinázokat és az EBR-t is. Az élô kompatibilis baktériumra azonban nem hat az EBR, vagy eddig még nem ismert úton hatástalanítja a védekezési mechanizmust. Ezt az jelzi, hogy az élô P. tabaci dohányba injektálása után a két kitináz megjelenése nem volt megfigyelhetô (2.ábra).
A betegség kialakulásának elôrehaladtával más fehérjék mennyisége megnövekszik, viszont a két kitináz még 24 óra után sem jelenik meg, amit a kitinázaktivitási teszt negatív eredménye is igazol. A kompatitibilis P. tabaci-fertôzés és az EBR-hez kapcsolható kitinázok vonatkozásában azonban megfigyeltünk bizonyos mennyiségi összefüggéseket. Ha nagyszámú, 109 kompatibilis baktériumsejtet injektáltunk a dohányba, akkor a sejtközötti folyadékban gyengén megjelentek a kitinázok (nem mutatjuk). Ebbôl arra lehet következtetni, hogy ilyen nagyszámú baktérium már nem tudja elkerülni a növény felismerô mechanizmusát, így az EBR gyenge kialakulása elkezdôdik, a kitinázok megjelennek a sejtközötti folyadékban, viszont a kompatibilis baktérium egyben hatástalanítani is tudja e mechanizmust, ezért végül kialakul a betegség.
Vizsgálatok az EBR elicitorának meghatározására
Kísérleteinkben élô P. tabaci nem indukálta az EBR-t, de az elölt baktérium igen, ebbôl arra következtethetünk, hogy az EBR elicitora v. elicitorai valamilyen általánosan jelenlévô baktériumkomponensek.
Szintetikus flagellint (flg15 – a flagellinfehérje konzervált régiójának 15 aminosavas szakasza) dohányba injektálva nem alakult ki az EBR, és a kitinázok sem voltak megtalálhatóak a sejtközötti folyadékban (3. ábra).
LPS-t injektálva a levelekbe csak az injektálást követô 48. órában jelentek meg a kitinázok, de sokkal gyengébben, mint azt a hôvel elölt baktérium indukálja. Tehát az LPS is gyenge elicitorként mûködött, fôleg ha figyelembe vesszük az EBR-rel kapcsolatos kitinázok 2–6 órás megjelenési idejét. További vizsgálatokat kell végeznünk annak megállapítására, hogy az LPS esetlegesen a késôi általános rezisztencia (LBR) indukálásában részt vesz-e.
Gram-pozitív, flagellum nélküli Micrococcus lisodeicticus dohányba injektálása után mind az EBR, mind a kitinázok már 6 órával a kezelés után megfigyelhetôk, és mennyiségük alakulása a sejtközötti folyadékban megegyezik a hôvel elölt baktériumnál megfigyeltekkel. Bár az LPS és flagellin elicitorok kitinázindukáló szerepét még nem zárhatjuk ki teljesen, létezniük kell egyéb, erôsebb elicitoroknak, amelyek mind a Gram-pozitív, mind a Gram-negatív baktériumokban egyaránt megvannak és indukálják az EBR-t. Egyelôre tehát az EBR elicitora továbbra is ismeretlen maradt, kiderítése további kísérleteink fontos célkitûzése marad.
PR fehérje indukáló kezelések vizsgálata
Az irodalom szerint a PR fehérjék a növényi védekezési mechanizmusok szerves részei. Szerepük, egyes PR fehérjék hatásmechanizmusa azonban még nem egyértelmû, ezért elvégeztünk néhány, az irodalomból ismert PR fehérjét indukáló kezelést.
A dohány vízzel való injektálása során az injektálás nyomán sérülések keletkeznek, de ezek sem kitináztermelést, sem EBR-t nem indukáltak a dohányban. A vizet mint kontrollkezelést használtuk.
A 0,4 M-os mannitololdat dohányba injektálásával ozmotikus, 0,2 M-os konyhasóval só, 40 µM paraquat és 0,3 M hidrogén-peroxiddal oxidatív stresszhatást idéztünk elô és vizsgáltuk a kitinázok elôfordulását a sejtközötti folyadékban (4. ábra). A kitinázok nem jelentek meg a dohány sejtközötti folyadékában, kivéve a konyhasóoldatot, amely esetben a kitinázok kismértékben megjelentek. Az új kitinázok tehát eltérnek a már ismert PR fehérjéktôl abban, hogy sebzés, abiotikus stresszek esetén nem figyelhetôk meg.
Az etilén és jázmonsav hormonok, valamint a szalicilsav szerepe ismert más védekezési mechanizmusokban.
Növénybe injektálásuk PR fehérjék termelôdését eredményezi.
A 100 µM jázmonsav vagy 1 mM 1-amino-ciklopropán-karboxilsav, az etilén prekurzorának dohánylevelekbe injektálását követôen azonban az új kitinázok nem voltak felfedezhetôk a sejtközötti folyadékban. A 0,6 mM szalicilsav-kezelés esetén, a legérzékenyebb ezüstfestés módszerrel, a kimutathatóság alsó határát súroló kifejezôdést kaptunk (nem mutatjuk).
Az EBR-ben a vizsgált hírvivô molekulák (szalicilsav, jazmonsav, tilén) tehát nem játszhatnak olyan fontos szerepet, mint más védekezési mechanizmusokban, mint pl. a HR-nél és a szisztemikus szerzett rezisztenciánál (SAR).
Ehhez hozzátartozik az is, hogy az EBR lokális, nem szisztemizálódik. Ezt bizonyítja, hogy az EBR-t indukáló és ez által HR-t gátló elôkezeléssel a szomszédos, nem kezelt levélszövetben az élô, inkompatibilis baktérium képes HR-t okozni.
Ezek a vizsgálatok azt mutatják, hogy az EBR-hez kapcsolható kitinázok inkább köthetôk baktérium általi indukcióhoz, mint sérüléshez, stresszek vagy különbözô hormonok és szalicilsav általi indukcióhoz. Ezek alapján úgy gondoljuk, hogy az általános védekezési mechanizmusnak fontos tényezôi a kitinázok, és így szerepet játszanak abban, hogy a növényvilág meg tudja magát védeni a mikroorganizmusok inváziójától. További célkitûzésként szerepel az új kitinázok esetleges lizozimaktivitásának megállapítása. A lizozimaktivitás kimutatásával és a baktériumra való hatásának vizsgálatával, egy lépéssel tovább juthatunk a korai általános rezisztencia baktériumgátló mechanizmusának megismerésében.
Eredményeink összegzésébôl (3. táblázat) kitûnik az EBR és a vizsgált 215 és 250 jelû (a fehérjéknek gélbeni vándorlási távolságuk alapján adott jelzése) kitinázok szoros kapcsoltsága, ezért a további kísérleteinkben e két fehérjét, mint EBR markert használhatjuk. Ezáltal már nem csak közvetetten, hanem közvetlenül is kimutatható
a korai általános rezisztencia.
Köszönetnyilvánítás
A dolgozatban ismertetett kutatások az OTKA Ts038302, Ts040835 és T037916 sz. pályázatainak támogatásával készültek.
Varga Gabriella J., Ott Péter G., Klement Zoltán
(MTA Növényvédelmi Kutatóintézete, 1022 Budapest, Herman Ottó u. 15.)
Klement Éva, Medzihradszky F. Katalin
(MTA Szegedi Biológiai Központ, Tömegspektrometriai Laboratórium, 6726 Szeged, Temesvári krt. 62.)
Növényvédelem 41 (7), 2005
Forrás: Növényvédelem
