Konídiumainak mérete és burgonya-dextróz-agaron képzett tenyészete alapján a másik két Monilinia fajtól egyértelmûen elkülöníthetô. A molekuláris genetikai vizsgálat is azonosította a Monilinia fructicola kórokozót, melyhez az EPPO protokolljában elôírt nukleinsav alapú PCR módszert alkalmaztuk.
Magyarországon az ôszibarack termésén két Monilinia faj okoz rothadásos tüneteket, a Monilinia laxa és a Monilinia fructigena.
A Monilinia fructicola kártételét hazánkban még nem találták meg. A tény, hogy ez a karantén kórokozó import gyümölcsszállítmányokkal bekerülhet országunkba, magában hordozza az elterjedés veszélyét.
Irodalmi áttekintés
A Monilinia fructicola (G. Winter) Honey okozta virág- és hajtáselhalás, valamint gyümölcsrothadás a világ számos részén a csonthéjasok meghatározó betegsége (Batra 1991). Az irodalmi adatok szerint az ôszibarack termésén Európában és hazánkban a Monilinia laxa és a Monilinia fructigena okoz rothadást (Wormald 1954). A Monilia polystroma, mely a M. fructigena közeli rokona, csak Japánból ismert (Van Leeuwen és mtsai 2002). A Monilinia fructicola kórokozót az EPPO A2 listája karantén kórokozóként említi, csak Franciaországból (OEPP/EPPO 2002) és Ausztriából jelezték szórványos elôfordulását, Európa többi országában egyáltalán nem fordul elô (OEPP/EPPO 2003). A kórokozó lappangási idôszaka nagyon rövid, akár már 24 órán belül észlelhetôk az elsô tünetek. Az ôszibarack termésén okozott rothadás mindig kis, barna folttal kezdôdik, mely gyorsan növekszik, végül az egész gyümölcsre kiterjed (Wormald 1954). A rothadás indulhat egy vagy több pontból (Agrios 1997). Eközben a gyümölcs felületén számtalan, szürkés színû fruktifikáció jelenik meg, mely végül a teljes felületet beborítja. A Monilinia fructicola elôzetes sérülés nélkül is megfertôzheti az ôszbarackot a légzônyílásokon és a szôrök talpazatán keresztül (Wormald 1954).
A konídiumok egysejtûek, citrom alakúak, hialinok, nagy tömegben azonban a kórokozóra jellemzô színûek (Batra 1991), közöttük diszjunktorok nem találhatók (Goidànich 1964).
A konídiumok a micéliumon elágazó láncokban képzôdnek, melyek átlagos mérete Batra (1991) szerint 14–16 × 9–11,5 µm. A gomba csírázásra képtelen mikrokonídiumokat is fejleszt (Agrios 1997). A Monilinia fajok tenyésztésére a táptalajok közül a burgonya-dextróz-agar az egyik legmegfelelôbb (Wormald 1954). A szerzô szerint ezen a közegen a Monilinia laxa és a Monilinia fructigena nem vagy csak igen csekély mértékben képez konídiumot, ezzel szemben a Monilinia fructicola bôségesen sporulál.
Számos módszert alkalmaznak a Monilinia fajok azonosítására molekuláris biológiai módszerekkel. PCR módszert dolgoztak ki a riboszóma kis alegységében lévô intron (group I intron) szekvenciára (Fulton és Brown 1997).
Egyes Monilinia fructicola-izolátumok nem tartalmazták az intron szekvenciát (Fulton és mtsai 1999), ezért a nagyobb megbízhatóság végett a 18S és 28S rRNS gének közötti ITS1 (Internal Transcribed Spacer) régió egy részét, az 5,8S rRNS gént és az ITS2 régió egy részét felismerô primerpárokat állítottak elô (Ioos és Frey 2000), melyek specifikusak voltak a Monilinia laxa, M. fructigena és a M. fructicola kórokozókra. Más PCR primereket is terveztek, melyek fajspecifikusak (Hughes és mtsai 2000), illetve M. fructicola- specifikusak voltak (Förster és Adaskaveg 2000). Újabban a multiplex PCR eljárás kifejlesztésével még egyszerûbbé vált a Monilinia fajok azonosítása. Ebben az esetben a PCR termékek mérete alapján lehet az egyes fajokat meghatározni egy PCR reakció alapján (Coˆ té és mtsai 2004). Ez a módszer a másik három Monilinia fajon kívül a M. polystroma kimutatására is alkalmas.
Anyag és módszer
A rothadásos tüneteket mutató ôszibarackokat 2005. októberének elején Budapest egyik piacán és két különbözô áruházlánchoz tartozó bevásárlóközpontban vásároltuk meg. A gyümölcsök közül az egyik fajtát a Budapest Corvinus Egyetem Gyümölcstermô Növények Tanszéke ’Michelini’-ként azonosította. A vizsgálatokat az egyetem Növénykórtani Tanszékén, valamint a gödöllôi Mezôgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont Virológiai Laboratóriumában végeztük.
A kórokozót morfológiai és tenyészbélyegek alapján azonosítottuk, patogenitását egészséges gyümölcsökre való inokulációval bizonyítottuk. Az átlagos konídiumméretet 100–100 konídium megmérése után határoztuk meg. A tenyésztéshez burgonya-dextróz-agart (PDA) használtunk. A kolóniákat egyenletes hômérsékleten, 22 °C-on termosztátban, sötétben tartottuk, átmérôjüket naponta mértük. A patogenitás igazolásához sterilizált, érett ôszibarackgyümölcsöket használtunk. A gyümölcsökön sebzést ejtettünk, és egy részüket a
kórokozó konídiumaival fertôztük. Mind az inokulált, mind a kontroll gyümölcsöket szobahômérsékleten steril üvegedényben tartottuk. A megfelelô páratartalomról nedves szûrôpapírral gondoskodtunk. Az eredményeket 5 nap elteltével értékeltük.
A molekuláris azonosítás során vizsgáltuk az olasz és a spanyol import barackról származó kórokozókat, valamint pozitív kontrollként ismert Monilinia laxa és Monilinia fructigena izolátumokat használtunk. A DNS-t PDA táptalajon nevelt tiszta tenyészetekbôl, ill. közvetlenül az ôszibarack felületérôl nyertük. A telepeket dörzscsészében homogenizáltuk, majd CTAB puffer hozzáadása után a keletkezett elegyet 65 °C-on 45 percen keresztül inkubáltuk.
Izoamil-alkoholos kloroform extrakcióval eltávolítottuk a szennyezôdéseket és a fehérjéket. A nukleinsavakat izopropanollal kicsaptuk, majd centrifugálás után a pelletet 70%-os etanollal kétszer mostuk. A pelletet beszárítottuk, majd 50 µl 10 µg/ml RNase-t tartalmazó TE pufferben oldottuk vissza (Maniatis és mtsai
1989). Mintánként a következôket mértük össze a PCR csövekbe: 5 µl össznukleinsav-kivonat, 5 µl 10×-es reakció puffer, 3 µl 25 mM-os MgCl2, 2 µl 5 mM-os dNTPs, 1 µl 20 pmol-os oligo1, 1 µl 20 pmol-os oligo2, 0,5 µl (2, unit) Taq polimeráz Fermentas és 32,5 µl steril víz. A Monilinia fructicola-izolátumokat és a pozitív kontrollként használt Monilinia laxa- és Monilinia fructigena-izolátumokat három fajspecifikus primerpárral teszteltük. Monilia
fructicola, Monilia laxa és Monilia fructigenaspecifikus primereket használtunk a PCR reakcióban, melyek kórokozók 18S és 28S rRNS gének közötti ITS1 (Internal Transcribed Spacer) régió egy részét, az 5,8S rRNS gént és az ITS2 régió egy részét emelik ki (Ioos and Frey 2000):
ITS1Mfcl: 5’-TATGCTCGCCAGAGGATAATT-3’, ITS4Mfcl:5’-TGGGTTTTGGCAGAAGCACACTA-3’, ITS1Mlx:5’-TATGCTCGCCAGAGAATAATC-3’, ITS4Mlx:5’-TGGGTTTTGGCAGAAGCACACC-3’, ITS1Mfg: 5’-CACGCTCGCCAGAGAATAACC-3’,ITS4Mfg: 5’-GGTGTTTTGGCAGAAGCACACT-3’.
A PCR ciklus a következô részekbôl tevôdött össze: a 3 perc 94 °C-on történô denaturálást 30 ciklus követte, mely 30 mp 94 °C-os denaturálást, 30 mp 65 °C-os primer kötést és 90 mp 72 °C-os láncépítést tartalmazott, majd ezt 10 percig tartó 72 °C-os ciklus követte (Ioos és Frey 2000). A PCR termékeket (kb. 350 bázispár) 1%-os agarózgélben megfuttattuk, etidiumbromiddal festettük, UV fényben láthatóvá tettük, majd az eredményt értékeltük.
Eredmények
Tünetek
Az ôszibarack termésén kezdetben apró, besüppedô barnás foltok láthatók, melyek gyakran a kocsány felôl indulnak. A héj alatt a gyümölcs húsa barnul. A rothadás gyorsan terjed, és ezzel egy idôben apró szürkés exogén sztrómák jelennek meg a foltokon, melyek késôbb a gyümölcs felületét teljes mértékben befedik.
Azonosítás morfológiai és tenyészbélyegek alapján, patogenitási vizsgálat
A Monilinia fructicola konídiumai egysejtûek,hialinok (nagy tömegben szürkések), citrom alakúak, átlagos méretük: 15,7×10,3 µm (olasz import) és 16,4×10,5 µm (spanyol import) volt. A konídiumok elágazó, monilínia típusú konídiumláncokban képzôdtek a sztrómákon. A kórokozó burgonya-dextróz-agaron a leoltási pontból kiindulva szabályos kör alakú tenyészetet képezve, lineáris ütemben, gyorsan növekedett (10,7 mm/nap). A telep barnásszürkés színû, nem zonált, széle nem karéjos.
A leoltási pontnál gyakran sötétebb micéliumtömörülés látható. A táptalajon nagy mennyiségû konídium képzôdött koncentrikus körökbe rendezôdve.
A patogenitási vizsgálat során valamennyi inokulált gyümölcs erôs rothadásos tüneteket mutatott. A sebzés körül keletkezett barna foltokban szürkés exogén sztrómák tömege jelent meg. A kontroll gyümölcsök egészségesek maradtak.
Azonosítás molekuláris genetikai módszerrel
A Monilinia fructicola, a Monilinia laxa és a Monilinia fructigena primerpárjai specifikusan mûködtek, egymással keresztreakciót nem adtak. Az olasz és spanyol importból származó ôszibarackon talált kórokozót a PCR vizsgálat is Monilinia fructicolaként azonosította.
Következtetések
A Monilinia fructicola karantén kórokozó elôfordulását Európában csak Franciaországból (OEPP/EPPO 2002) és Ausztriából (OEPP/EPPO 2003) jelezték. Magyarországról eddig még nem azonosították.
Az általunk leírt gyors, erôs rothadás és a nagy mennyiségben képzôdô exogén sztróma megegyezik Wormald (1954) és Agrios (1997) megfigyeléseivel. A konídiumok egysejtûek, oválisak, hialinok, láncokban képzôdnek, ez egybevág Batra (1991) tapasztalataival. Goidànichhoz (1964) hasonlóan diszjunktorok képzését nem észleltük. A konídiumok átlagos méretei megegyeznek Batra (1991) méréseivel. A Monilinia fructicola tenyésztésére a burgonya-dextróz-agar megfelelônek bizonyult, a kórokozó tenyészete, Wormald (1954) megfigyeléseihez hasonlóan egyértelmûen elkülöníthetô a Monilinia laxa és a Monilinia fructigena kolóniáitól.
Az EPPO protokolljában elôírt nukleinsav alapú PCR módszer megerôsítette a morfológiai és tenyészbélyegek alapján való azonosítást.
Ioos és Frey (2000) szerint ajánlott primerkötési hômérsékletet 62,5 °C-ról 65 °C-ra emeltük, mivel a M. laxa és M. fructigena primerpárok bizonyos mértékû keresztreakciót adtak.
A Monilinia fructicola az import szállítmányokkal bizonyítottan a kereskedelembe került. Feltehetôen a vásárlók a kommunális hulladékba dobták a gyorsan elrothadt gyümölcsöket, így fennáll a veszélye, hogy a kórokozó a gyümölcsmúmiákon áttelel. Tavasszal – kedvezô idôjárási feltételek között – elképzelhetô, hogy fertôzôképes konídiumokat és/vagy aszkospórákat hoz létre. A következô esztendôben tehát fokozott figyelemmel kell kísérni a betegség megjelenését a csonthéjas ültetvényekben. Az import szállítmányok folyamatos ellenôrzése is szükséges, hiszen az EPPO 2005. márciusi adatai alapján a kórokozó sem Olaszországban, sem Spanyolországban nincs jelen. A karantén kórokozót,az EPPO protokoll szerinti azonosítását követôen, azonnal bejelentettük az illetékes FVM Növény- és Talajvédelmi Szolgálatához.
Petróczy Marietta és Palkovics László
Budapesti Corvinus Egyetem, Kertészettudományi Kar, Növénykórtani Tanszék
1118 Budapest, Villányi út 29–43.
Növényvédelem 41 (12), 2005
Forrás: Növényvédelem
