Az egészséges szaporítóanyag elôállításának legegyszerûbb és talán leghatásosabb módja a törzsültetvények folyamatos megfigyelése és többlépcsôs ellenôrzése (Németh 1990). Alapvetô, hogy az ültetvény fertôzésmentességére vonatkozólag visszamenôleg legalább öt évre megbízható adataink legyenek. Lehoczky János megfigyelései alapján ugyanis a látensen fertôzött tôkék még nyolc év eltelte után is tumorossá válhatnak.
A fertôzésmentesség bizonyítására a leghatásosabb mód, ha az ültetvényt rendszeresen alaposan átjárjuk, és szemügyre vesszük a tôketörzseket. Ha az ültetvényben legalább öt éven keresztül nem látunk beteg tôkéket, akkor nagy valószínûséggel állíthatjuk, hogy az ültetvény agrobaktérium-mentes. Ha további megerôsítésekre van szükségünk, akkor különbözô termesztéstechnikai és növénykórtani módszerekkel bizonyíthatjuk azt. Ennek egyik módja a negatív szelekció, melynek az a lényege, hogy a szaporítóanyagtermesztés folyamatának lehetôleg több lépésében ellenôrizzük a kiindulási anyagot, másrészt, hogy valamilyen technológiai eljárással, kezeléssel baktériummentes anyagot állítunk elô a szaporításra szánt tételekbôl. Az újonnan telepített szôlôültetvények fertôzôdésének megelôzésére alapvetô fontosságú, hogy olyan területre ne telepítsünk szôlôt, ahol korábban golyvás ültetvény volt, mivel a talajban maradt gyökerekben a baktérium évekig fennmaradhat (Burr és mtsai 1995).
A) Lehetôségek a szaporítóanyag diagnosztikai vizsgálatára
A fertôzés kimutatása ültetvényekbôl: könnyezésinedv-analízis és opin teszt segítségével
Az agrobaktérium kimutatásának elsô lép- csôje az üzemi törzsültetvények vizsgálata a szaporítóanyag gyûjtést megelôzôen. A vizuális, tüneti szelekció mellett ennek egyik lehetséges módja, hogy a vegetációs idôszak kezdetekor (Magyarországon általában áprilisban), a nedvkeringés megindulása után a könnyezési nedvet vizsgáljuk a patogén baktérium jelenlétére vonatkozólag.
A szôlô könnyezési nedve, kémiai összetételét tekintve, tápanyagokban rendkívül gazdag, így megfelelô hômérséklet esetén ideális közeg az endogén mikrobióta számára. A könnyû és egyszerû mintavételi lehetôség mellett ez nagymértékben elôsegíti a szôlôben élô baktériumok izolálását és azonosítását. Tudomásunk szerint szôlô könnyezési nedvébôl elôször Lehoczky János mutatta ki az agrobaktériumot. A nyolcéves golyvás „Afuz Ali” tôkék egy-két éves vesszôinek internodiális részébôl gyûjtött mintákban milliliterenként 4,7–9,3 X104 baktériumsejtet talált, melyek három–öt morfológiailag különbözô csoportot alkottak. Az agrobaktérium becsült sejtszáma 7,0–15 X103/ml volt. A vizsgált 9 tôke könnye zési nedvének mintáiból 16 agrobaktérium-szerû telepet izolált, amelyekbôl négy telep bizonyult patogénnek napraforgón (Lehoczky 1968b). Az Egyesült Államokban 19 szôlôfajta 24 golyvás és 17 tünetileg egészséges tôkéjébôl gyûjtöttek és vizsgáltak könnyezésinedv-mintákat agrobaktérium-tartalomra, különbözô táptalajokon történô kitenyésztéssel. A 24 golyvás tôkérôl gyûjtött mintából hét tartalmazott virulens A. tumefacienst, a 17 egészséges tôkérôl származó könnyezésinedv-minták közül pedig csak egybôl volt kimutatható a patogén.
Tíz telep biokémiai, és patogenitástesztekkel történô jellemzése alapján valamennyi A. vitis volt. Ennek alapján, ha kis százalékban is, de kimutatták a látens fertôzést egészséges tôkékbôl is (Burr és Katz 1983). Iráni kutatók fertôzött tôkékrôl származó szôlôkönnyezési nedvbôl, tumorok- ból és talajból összesen 32 agrobaktérium-tele- pet izoláltak. Ezek közül 22 telep A. vitis, 6 telep A. tumefaciens és 4 telep pedig A. rhizogenes volt. Az izolált telepek közül 7 volt patogén, és mindegyikük könnyezési nedvbôl származott (Mohammadi és Fatehi-Paykani 1999). A mintákat közvetlenül a tünet feletti többéves fás részbôl gyûjtötték. Magyarországon 18 éves Rajnai rizling és Cabernet Sauvignon tôkéket vizsgáltunk. Az egyéves vesszôkbôl gyûjtött könnyezési nedvbôl szénforrásként tartarátot tartalmazó félszelektív táptalajon tenyésztettük ki az A. vitist.
Az izolált telepeket PCR-rel és patogenitásteszttel azonosítottuk. A hat tünetmentes növényrôl származó minta közül egy tartalmazott patogén A. vitist. A tíz golyvás tôke mintáiból kettô volt pozitív, tehát ezekbôl is hasonló arányban lehetett izolálni virulens baktériumsejteket (Szegedi és Bottka 2002). Ezek az eredmények megközelítôen megegyezôek a korábban kapott adatokkal (Lehoczky 1968b, Burr és Katz 1983). Pu és Goodman (1993b) elôzetesen tesztelt agrobaktérium-mentes növényeket ültettek ki szabadföldi körülmények közé, olyan területre, ahol korábban erôsen fertôzött szôlôk voltak. Mintegy két év után áprilisban gyûjtött könnyezési nedvbôl kiindulva, a vizsgált 255 növénybôl 135-ben (53%) találtak agrobaktériumot. Stover és munkatársai (1997) üvegházi kísérletben a fertôzést követôen egy évvel a nö- vényeknek mintegy 5,3%-ából tudták kimutatni az A. vitist.
Ez arra utal, hogy az adott kísérleti körülmények között a baktérium lassan és egyenetlenül terjed a szôlôxylemben. Németország- ban 1986 és 1987 tavaszán nagyszámú, mintegy 70 mintával végzett vizsgálat során nem találtak a szôlô könnyezési nedvében patogén agrobak- tériumot (Jäger és mtsai 1990). A könnyezési nedv analízise a fenti ellentmondásos eredmények következtében csak részben alkalmas a fertôzés biztonságos kimutatására. A módszer a vegetációs idôszak kezdetekor használható az ültetvények agrobaktérium-fertôzöttségének az ellenôrzésére, de számolni kell azzal, hogy a ki- mutathatóság nem 100%-os. Ezért nagyszámú minta vizsgálatára van szükség, és egy-egy tôkérôl is érdemes különbözô pontokról (eltérô edénynyalábokból) mintát venni. Ezzel jelentôs mértékben növelhetô a vizsgálati eredmények megbízhatósága.
Az agrobaktérium által indukált tumorok jellemzô sajátsága, hogy a tumorokban olyan új vegyületek, fôleg aminosav-származékok termelôdnek, melyek kizárólag csak ezekben a kóros szövetekben fordulnak elô. Ezeket a speciális aminosavakat összefoglaló néven opinoknak nevezzük. Ma már több mint 20 opinvegyületet ismerünk. Az opintermelés a tumort indukáló agrobaktérium által meghatározott. A tumoros növényi sejt az opinokat a környezetbe kiválasztja, és azokat a tumort indukáló baktérium képes szelektív tápanyagforrásként hasznosítani. Az opintermelés (a golyvás növényi szövetben), illetve hasznosítás (az indukáló baktérium által) az Agrobacterium nemzetség plazmidjainak jellemzô tulajdonsága (Dessaux és mtsai 1998). A plazmid típusának meghatározása mellett azonban a vélhetôen tumoros növényi szövetek opintartalmának elemzése esetenként hasznos diagnosztikai módszer is lehet. Ezek a vegyületek egyszerû laboratóriumi háttérrel, elektroforézissel olcsón és könnyen kimutathatók, ezért növényegészségügyi alkalmazásuk indokolt lenne.
A korábbi években hét szôlôfajtáról mintegy 90 tumormintát gyûjtöttünk, különbözô termôhelyekrôl. Ezek közül 85-ben tudtunk kimutatni A. vitisre jellemzô opinvegyületet. A tumormintákból izolált össz- DNS PCR analízise alapján a minták 85%-a volt mindkét tesztben pozitív (Szegedi 2003). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az opinteszt hasznos kiegészítô módszer lehet a szôlô agrobaktérium-fertôzöttségének bizonyításában. Szabadföldi körülmények között, ha ritkán is, de kialakulhatnak golyvaszerû tünetek a különbözô sérülések, esetleg hormonhatású gyomirtó szerek alkalmazásának a következtében is. Szôlôoltványok elôállításakor a gyökértörzs alapi részén és az oltási helyen gyakran képzôdnek különbözô méretû kalluszok, melyek vizuálisan nem mindig különíthetôk el egyértelmûen az agrobaktériumok indukálta tumoroktól. Ilyen esetekben az opinteszt hasznos kiegészítô módszer lehet, de használata a vegetációs idôszakra korlátozódik. A korhadó fás tumorokból ugyanis már nem lehet az opinokat kimutatni.
Szaporítóanyag-ellenôrzés: kimutatás egyéves fás vesszôkbôl
Az agrobaktérium-indexelés gyakorlat számára talán legfontosabb része a szaporításra, illetôleg oltványkészítésre használt egyéves fás vesszôkbôl történô kimutatás. A baktérium kinyerésére alapvetôen két módszer lehetséges. Egyik a vesszôrészek homogenizálásán és szuszpendálásán alapul. Ennek során a feltárt növényi részekbôl (ízköz, nódusz) izoláljuk a baktériumot. A másik a vesszôátmosás módszere, melynek során a vesszôn túlnyomással (Tarbah és Goodman 1986) vagy vákuummal (Ophel és mtsai 1988, Burr és mtsai 1989) steril vizet préselünk (szívatunk) keresztül, és az átmosatással kapott szövetnedvmintát szélesztjük táptalajon.
Ezeken kívül kinyerhetünk még szövetnedvet centrifugálással is (Burr és mtsai, 1988). Mindegyik módszer esetében nagyfokú korlátozó tényezô lehet az agrobaktérium-sejtszám jelentôs szezonális változása a növényben, továbbá, hogy a patogén agrobaktérium-sejtek feltehetôen kötôdnek a gazdanövény edénnyalábrendszerében a sejtfalakhoz. Így az élô sejtek kinyerésének hatékonysága sok esetben nem megfelelô. A szôlôszaporítóanyag-termesztés kiindulási anyaga szinte kizárólag az egyéves, fás simavesszô, melyeket általában a kora téli idôszakban gyûjtenek be, és felületi fertôtlenítés után raktároznak. A termesztéstechnológia szempontjából ezek növényegészségügyi ellenôrzésére lenne a legnagyobb igény, ha a patogén megfelelô megbízhatósággal kimutatható lenne a vesszôkbôl.
Azt követôen, hogy Lehoczky János (Lehoczky 1968b, 1971) bizonyította az agrobaktérium szisztemikus terjedését a szôlôben, számos diagnosztikai célú vizsgálat történt a szôlôhajtások és vesszôk fertôzöttségének a vizsgálatára. Goodman és mtsai a szôlôvesszôkbôl vágott dugványokat nyomáskamrába helyezve az átmosás módszerével a félszelektív Roy-Sasser táptalajon izoláltak Agrobacterium spp.-t különbözô fajták érett, egészséges vesszôinek xylemjébôl. A kinyert telepek közül 36-ot vizsgáltak biokémiai és patogenitás-tesztekkel. Ebbôl 31 bizonyult patogén A. vitis- nek (Tarbah és Goodman 1986). Eredményeik alapján az átmosással kimutatható a szôlôvesszôkben csekély koncentrációban és egyenetlen eloszlásban jelen lévô agrobaktérium. További fontos eredményük annak bizonyítása, hogy a baktériumsejtszám a szôlôvesszôben a hajtáscsúcs felé haladva csökken, és a csúcsi rész már jelentôs mértékben mentes a fertôzéstôl. Ezekre az eredményekre alapozva elôállítható patogénmentes kiindulási anyag törzsültetvények létrehozására. Zölddugványozással szaporított szôlôben már csak az alapi részbôl tudtak kimutatni fertôzést, így ez a módszer még inkább alkalmas lehet a szôlô agrobaktérium-mentesítésére (l. alább). További kísérletekben zölddugványozással mintegy 200–200 gyökeres növényt állítottak elô Catawba, Seyval blanc, Vidal blanc, Chancellor és Reliance fajták augusztusban gyûjtött hajtásaiból. Ugyanezen fajtákból fás dugványozással is hasonló mennyiségû növényt gyökereztettek meg. A szôlônövények vesszôinek agrobaktérium-tartalmát átmosással vizsgálták. A zöld hajtásból szaporított tételek fertôzöttsége lényegesen kisebb volt (0–10%), mint a fás dugványról hajtatott anyagé (0–53%). Szabadföldrôl gyûjtött tünetmentes érett, fás vesszômintákból rendkívül nagy, mint- egy 60%-os fertôzöttséget állapítottak meg (Goodman és mtsai 1987).
Ezeket a mintákat márciusban gyûjtötték Kaliforniában. Ekkor ott már megindulhatott a nedvkeringés, amivel együtt jár a baktérium felszaporodása a növény- ben. A zöld hajtásról szaporított növényekben való esetenkénti elôfordulás lehetséges oka, hogy az anyagot augusztusban hajtatták, amikor már megkezdôdik a lignifikáció. Ilyenkor a baktérium már felvándorolhat az új hajtásokba (Burr és mtsai 1988). Annak vizsgálatára, hogy a szôlô szabadföldi körülmények között milyen gyorsan fertôzôdik, négy szôlôfajta agrobaktérium-mentes egyedeit olyan „provokatív” területre ültették, ahol korábban golyvás Chancellor szôlôültetvény volt. A vizsgált növények 16 hónap után még mentesek voltak a fertôzéstôl, mivel a júliusban gyûjtött zöld hajtásokból az agrobaktérium nem volt kimutatható. Mintegy két év után (következô év április) gyûjtött könnyezésinedv-mintáknak viszont már mintegy 32%- a volt A. vitis-pozitív. Ugyanezen év októberében és decemberében gyûjtött vesszôkbôl a patogén viszont alig (mindössze 2%-ban) vagy egyáltalán nem volt kimutatható. A következô év áprilisában a vizsgált növényeknek ismét mintegy 25%-ában találtak agrobaktériumot (Pu és Goodman 1993b). Ennek alapján megállapítható, hogy a szôlôben a patogén sejtszáma jelentôs évi ciklikus változást mutat. A tavasszal gyûjtött vesszôkbôl és könnyezési nedvbôl könnyen és nagy gyakorisággal kimutatható az agrbaktérium, ôsszel és télen viszont a vesszôkben rendkívül kicsi a sejtszám.
A szôlô könnyezési nedve nagy tápanyagtartalma következtében nyilvánvalóan optimális közeg az A. vitis és sok más baktérium felszaporodásához. Ezzel magyarázható, hogy a nedvkeringés megindulása után lényegesen könnyebb a patogén kimutatása szôlôbôl. A gyakorlatban azonban a téli fagyok miatt a vesszôket mindig ôsszel gyûjtik be, így a tavaszi minták tesztelése rutinszerûen nem alkalmazható.
Stover és mtsai (1997) mesterségesen fertôzött növények noduszainak homogenizálásával és szövetátmosással nyerte ki a szôlôvesszôk endogénbaktérium-tartalmát. A noduszok homogenizálásával a vizsgált mintáknak 12%-ából mutatta ki az agrobaktériumot, a fia- tal hajtásokon átpréselt szövetnedvben azon- ban nem talált patogént. Véleményük szerint a szövetátmosás hatékonysága nagyban fokozható, ha a víz felszívatása után a vesszôdarabokat –20 oC-on fagyasztjuk, ezt követôen pedig két napig 28 oC-on inkubáljuk. Bár a fagyasztás hatására az izolált agrobaktériumszerû telepek száma nagyságrendekkel növekedett, a vizsgált 62 mintából bizonyíthatóan (szerológiai módszerrel) csak kettô tartalmazott A. vitist. A folyadékfelszívatást követô fagyasztás hasznossága megkérdôjelezhetô, mivel fagyasztás hatására az A. vitis sejtek jelentôs része elpusztulhat.
Lehoczky (1971) a felületileg fertôtlenített vesszôkbôl rügydugványokat készített, ezt steril közegben hajtatta optimális hômérsékleten (23–28 oC), majd a frissen képzôdött kalluszokat és gyökereket homogenizálta és a mintákat megfelelô táptalajon szélesztette.
Ez a módszer, bár lényegesen idô- és munkaigényesebb, de az esetek többségében igen eredményes. Burr és mtsai (1984, 1989) ezzel a módszerrel mintegy egy nagyságrenddel több baktériumot tudtak izolálni, mint a fentebb említett módszerekkel. Ennek az lehet a magyarázata, hogy a nyugalmi állapotban lévô vesszôkben csekély a víztartalom, és nem áll rendelkezésre a baktériumok számára hasznosítható tápanyag az edény- nyalábrendszerben. A hajtatás során a dugvány a környezetébôl vizet vesz fel, beindul a szôlôben az anyagcsere, ami megfelelô tápanyagot nyújt a vesszôben kis koncentrációban jelen lévô baktériumok számára. Így ott a sejtszám nô, aminek következtében lényegesen könnyebbé válik az esetleges fertôzés kimutatása. Burr és mtsai (1984) fertôzött tôkékrôl gyûjtött 187 vesszômintát hajtattak.
Ezek közül 30-ból mutatták ki az A. vitist (16%), és a vizsgált 417 telepbôl 131 (31%) volt patogén. A kísérletekhez a vesszômintákat a nedvkeringés megindulása elôtt, februárban gyûjtötték.
Hazánkban Németh József (Németh 1990) 29 tumoros és 25 tünetmentes tételbôl mintegy 2160 vesszôt dolgozott fel. A baktérium kinyerése céljából a vesszôket nyomással vagy vákuummal átmosta, és az így nyert szuszpenziót használta a patogén kitenyésztésére. A tünetileg fertôzött tôkékrôl származó 29 tételbôl mindössze öt, a 25 egészséges tételbôl pedig két esetben tudott agrobaktériumot izolálni. A tumoros tôkékrôl gyûjtött vesszôknek mindössze 3,2%-a bizonyult fertôzöttnek, bár az egyes tételek között jelentôs eltérések voltak. Ezek az arányok arra utalnak, hogy nyugalmi állapotban a vesszôkben nagyon kicsi a sejtszám, vagy az alkalmazott módszerek nem alkalmasak a patogén megfelelô érzékenységû diagnosztizálására. Lehoczky (1971) fertôzött Olimpia tôkékrôl gyûjtött egyéves, tünetmentes fás dugványokat kalluszosított, és a bazális részen képzôdött friss kalluszokat használta kiindulási forrásként a patogén kimutatására. A vizsgált négy telepbôl egy volt patogén napraforgón.
A fertôzés szisztemikus jellegének bizonyítására Lehoczky (1971) 25%-osnál nagyobb fertôzöttséget mutaó Olimpia szôlôfajta zöld hajtásait leoltotta tünetmentes 5C alanyra. Három év után a 120 fertôzött oltványból mindössze 8 növényen (6,7%) jelentek meg a tünetek, ami lényegesen kisebb a kiindulási anyag 25%-os fertôzöttségénél. Mivel a baktérium az alanyban is elôfordulhat gyakran látensen (Süle 1986, Süle és mtsai 1994), az agrobaktériumos fertôzés nemes- vagy alanyeredete nem bizonyítható.
Az agrobaktérium kimutatására Eastwell és mtsai (1995) a szôlô hajtásban történô sejtlízissel kinyert DNS-bôl PCR-re lényegesen hatékonyabban tudták kimutatni az A. vitist, mint a baktérium kitenyésztésével. Ennek feltételezhetô oka, hogy a növényben lévô baktériumok jelentôs része nem mobilizálható, mivel azok a növényi sejtfalhoz kötött állapotban vannak
(Cotado-Sampayo és mtsai 2001, Pu és Goodman 1993a).
Agrobaktérium-izolálás gyökérbôl
Az agrobaktérium elôfordulását fertôzött szôlô tünetmentes gyökerében elôször Lehoczky János mutatta ki. Rekord szôlôfajta egyéves fás dugványait nedves környezetben gyökereztetve a fiatal gyökércsúcsokból öt telepet izolált, ezek közül egy volt patogén. Ugyancsak Rekord szôlôfajta egy-két éves gyökerein sebzéssel indukált kalluszképzôdést, és a friss kalluszokból izolált négy telep mind patogén volt. Olimpia szôlôfajta gyökerein friss gyökerek gyökércsúcsaiból szintén eredményesen izolálta az agrobaktériumot (Lehoczky 1971). További kísérletekben Olimpia szôlôfajta 10 éves egyedeinek 13–16 mm átmérôjû (3–4 éves) gyökereinek xyemjébôl 26 agrobaktériumszerû telepet izolált, melyek közül 11 volt patogén napraforgón. A vizsgált 9 gyökérmintából azonban csak 3 esetben talált agrobaktériu- mot, ami a patogén növényen belüli egyenetlen eloszlására utal. Elôzetes vizsgálatai alapján a gyökér rezervoárként szolgál a szôlôt szisztemikusan fertôzô agrobaktérium-sejtek számára.
Tavasszal, a nedvkeringés („könnyezés”) megindulásakor a tápanyagdús szövetnedvben a baktériumok felszaporodnak, és a xylemtransz- porton keresztül elárasztják a növény föld feletti részeit, ahol belsô sérülések esetén megjelennek a tumorok (Lehoczky 1978). Süle (1986) ötéves, az alanyrészen tünetileg egészséges, de a nemes részen golyvás Merlot/5C tôkék gyökereinek agrobaktérium-tartalmát vizsgálta. A gyökérfelületen és a xylemben a patogén jelenléte nem volt kimutatható. A phloemból izolált telepek közül mintegy 12% (41-bôl öt) volt patogén. További kísérletekben a begyûjtött gyökérmintákon laboratóriumi körülmények között kalluszképzôdést indukált. A friss kalluszokból izolált baktériumtelepeknek viszont már mintegy 60%-a (a 98-ból 56) indukált tumorképzôdést a tesztnövényként használt napraforgón vagy paradicsomon. Ezek a kísérletek további bizonyítékot szolgáltatnak a fertôzés szisztemikus jellegére, mivel a baktérium kimutatható volt a tünetmentes alanyból is. Az Egyesült Államokban Burr és mtsai szintén idôsebb ültetvényekbôl gyûjtöttek gyökérmintákat.
A fertôzött tôkékrôl származó gyökerekbôl mindhárom esetben kimutatták a patogén jelenlétét, és a három tünetmentes tôkékrôl gyûjtött minta egyikébôl szintén izolálták a baktériumot. Ezt követôen további vizsgálatokat végeztek szaporítóanyag-iskolákból gyûjtött tünetmentes saját gyökerû és oltvány szaporítóanyagok gyökereinek analízisével. A 12 vizsgált növénybôl hét esetben mutatták ki az agrobaktériumot a gyökerekben és gyökérfelszínen (Burr és mtsai 1987). Ez arra utal, hogy a gyökerek analízise hatékony eszköz lehet növényegészségügyi diagnosztikai vizsgálatokra. Muscadina
(Vitis rotundifolia) szôlô gyökereibôl szintén nagy számban izoláltak agrobaktériumot, ezek
73%-a volt patogén (Thies és mtsai 1991). Vadon élô Vitis ripariagyökerekbôl kizárólag apatogén A. vitist izoláltak, melyek túlnyomó többsége atipikusan nem hasznosította a tartarátot (Burr és mtsai 1999). Az A. vitis fennmaradása a szôlô gyökereiben mintegy két évig kimutatható volt (Burr és mtsai 1995). Ez egyben azt is jelenti, hogy golyvás ültetvény kitermelésekor ügyelnünk kell a gyökérzet minél teljesebb eltávolítására, mivel a talajban maradt gyökérmaradványokban túlélô A. vitis sejtek ismételt szôlôtelepítéskor kiindulási forrásként szolgál- hatnak az új ültetvény fertôzôdéséhez. Ezek alapján a gyökérbôl történô izolálás, ha nem is 100%-os, de meglehetôsen megbízható mód- szernek tûnik a látens agrobaktérium-fertôzés kimutatásához. Ez a diagnosztikai lépés beilleszthetô a jelenlegi szaporítóanyag-termesztési technológiába, a szôlôszaporítóanyag-iskolák kitermelését követô idôszakban.
A kimutatás és azonosítás módszerei
Az utóbbi években jelentôs fejlôdés történt az indexelési módszerek (negatív szelekció) területén is. A növényegészségügyi-diagnosztikai vizsgálatokban a hagyományos eljárások (a patogén izolálása és azonosítása biokémiai és patogenitástesztekkel) mellett vagy azok kiegészítéseként, ma már egyre inkább elôtérbe került a modern molekuláris módszerek, mint például a polimeráz láncreakció alkalmazása (Louws és mtsai 1999, Moore és mtsai 2001).
Az agrobaktérium polimeráz-láncreakcióval (PCR) történô kimutatására elôször az Egyesült Államokban (Dong és mtsai 1992), majd Németországban (Schulz és mtsai 1993) kezdôdtek el a vizsgálatok. A kezdeti kísérletek, melyekben laboratóriumi törzstenyészeteket használtak a minta DNS-izolálásához, elsôdleges célja a megfelelô, általánosan alkalmazható, patogénspecifikus primerpárok (20–25 bp hosszúságú
„indítószekvenciák”) meghatározása volt.
Ennek megfelelôen a primereket virulenciagének vagy a T-DNS-en lévô onkogének szekvenciáinak alapján tervezték. Mivel a különbözô agrobaktérium törzsek Ti plazmidjain található virulenciarégió konzerváltabb, mint a T-DNS onkogénjei, ezért a vir-alapú primerek általánosabban használhatók, mint a Ti plazmid típusra lényegesen jellemzôbb onkogénspecifikus primerek (Haas és mtsai 1995). A PCR reakcióhoz használt primertôl függôen a reakció lehet fajspecifikus is, pl. a kromoszomálisan kódolt poligalakturonáz-génre tervezett primerek alkalmazása A. vitis kimutatására és azonosítására (Eastwell és mtsai 1995, Szegedi és Bottka 2002). Ezt követôen, illetve ezzel párhuzamosan elkezdôdtek a kísérletek az agrobaktériumos fertôzöttség növényi mintákból történô kimutatására is.
Ehhez alapvetôen két módszer használható, úgymint (1) az izolált baktériumtelepek azonosítása PCR-rel, vagy (2) növénybôl kinyert össz-DNS analízise. Az elôbbi módszer lényegesen megbízhatóbb, de sokkal munkaigényesebb is. Mivel a növényi kivonatokban jelentôs mennyiségben fordulnak elô a PCR-reakciót gátló polifenolok és poliszacharidok, ezért alapvetô, hogy a DNS tisztítására megfelelô módszert használjunk. Ilyenek például a többlépcsôs szerves extrakción alapuló izolálás vagy DNS-izoláló oszlopok használata (Eastwell és mtsai 1995, Cubero és mtsai 1999, Llop és mtsai 1999).
Mint már említettük, a szôlôvesszôben történô in situ baktérium sejtlízist követôen közvetlen PCR-rel megbízhatóbban ki tudták mutatni a patogént, mint a vesszôn keresztülpréselt folyadékból izolált tenyészetek felhasználásával (Eastwell és mtsai 1995). Ennek feltehetô oka, hogy az agrobaktérium-sejtek túlnyomó többsége a szôlôsejtfalakhoz kötött állapotban van (Pu és Goodman 1993a, Cotano-Sampayo és mtsai 2001). A kötött sejtekbôl a lízis pufferben lévô detergens (SDS) kioldotta a DNS-t, így az alkalmassá vált a vizsgálat számára, míg a xylem desztillált vizes átmosásával nem sikerült ezeket a baktériumokat mobilizálni. A növény- bôl való közvetlen kimutatás érzékenységének további fokozására a módszer kombinálható a szerológiai technikákkal is („immuncsapda”, Kauffman és mtsai 1996).
B) Szaporítóanyag tételek agrobaktérium-mentesítése
Az indexelés mellett az agrobaktériummentes szaporítóanyag elôállításának másik lehetôsége, amikor valamilyen eljárással elpusztítjuk a növényben lévô baktériumsejteket, vagy meg- felelô szaporítástechnológiai módszerrel patogénmentes anyagot állítunk elô. A fertôzés szisztemikus jellege miatt a kémiai alapokon nyugvó fertôtlenítés nem hatékony (Lehoczky 1980), de vannak egyéb módszerek, melyekkel jelentôs mértékben csökkenthetô a szaporítóanyag tételek fertôzöttsége.
Hôkezelés
A hôkezelési eljárás lényege, hogy a szaporítóanyag-tételeket olyan, viszonylag magas hômérsékleten kezelik, mely még nem károsítja a növényi szöveteket, de már elpusztítja a kórokozókat és egyéb kártevôket. Erre a célra egy megfelelô, rendkívül pontos fûtésszabályozással és keverôvel ellátott vízfürdôt használnak, mely biztosítja, hogy a víz hômérséklete a tartály minden pontján egy-két tized fok pontossággal megfeleljen a beállított értéknek. Bár hazánkban az eljárást még nem alkalmazzák a gyakorlatban, a hôkezelés alkalmazása szôlôszaporítóanyag-tételek kezelésére is már meglehetôsen régi múltra tekint vissza. Az elsô alkalmazások célja a filoxéra- és a fonálféreg-mentesítés volt, majd ezt követôen bizonyították, hogy hatékony a Pierce baktériummal (Xylella fastidiosa) és a Phytophthora fajokkal szemben is (Goussard 1977), valamint elpusztítja a szôlôrügyekben áttelelô atkákat (Dulinafka és mtsai 1995). Ezekívül a fitoplazma-mentesítésre is rendkívül hatékony, és ma már több országban általánosan alkalmazottá vált (Tassart-Subirats és mtsai
2003, Crocker és mtsai 2003).
Az A. vitis elleni alkalmazásra a 80-as évek végétôl került sor. Elsôként az USA-ban bizonyították, hogy az A. vitis törzsek 50 oC-on 20–25 perc alatt elpusztulnak, de az A. tumefaciens törzsek ellenállók voltak ezzel a hôhatással szemben (Burr és mtsai 1989). Késôbb hasonló jellegû vizsgálatokat végeztünk Magyarországon különbözô opincsoportokba tartozó A. vitis törzsek bevonásával. Ennek során megállapítottuk, hogy az opincsoportba való hovatartozástól függetlenül az oktopin-, a nopalin- vagy a vitopintörzsek vizes szuszpenzióban lévô sejtjei teljesen elpusztultak egy 50 oC-on történô 30 percig tartó, hôkezelést követôen (Szegedi és Szécsi 1994). A 90-es évek elsô felétôl a közelmúltig különbözô laboratóriumokban számos kísérletet végeztek annak tisztázására, hogy a hôkezelés alkalmas-e szôlôszaporítóanyag-tételek szisztemikus A. vitis-fertôzöttségének a megszüntetésére. A kísérletek során nyugalmi állapotban lévô alany- és nemes vesszôket áztattak 50–52 oC-on, 30–60 percig. Ez a kezelés, néhány esettôl eltekintve, általában nem ártott a szôlôrügyeknek, és nem befolyásolta az oltványkészítés szempontjából alapvetô fontosságú kalluszosodást.
Ez a kezelés je- lentôs számban gyéríti a szôlôvesszôben lévô látens A. vitis fertôzést, de – ellentétben a labo- ratóriumi vizsgálatok eredményeivel – in vivo nem pusztítja el teljes mértékben az agrobaktérium-sejteket (Bazzi és mtsai 1991, Burr és mtsai 1989, 1996, Ophel és mtsai 1990, Mahmoodzadeh és mtsai 2003). A laboratóriu mi és a szabadföldi kísérletek eredményei közötti különbség okát nem ismerjük. Annak elle- nére, hogy a hôkezelés az agrobaktériummal szemben nem 100%-os hatékonyságú, a módszer bevezetése és alkalmazása általános növényegészségügyi kezelésként az egyéb pozitív hatások (fitoplazma- és atkamentesítés) miatt is megfontolandó.
Zölddugványozás és zöldoltás
Tarbah és Goodman (1986) megfigyelései alapján az egyéves érett, fás vesszôkben az alapi résztôl a hajtáscsúcs felé haladva folyamatosan csökken az agrobaktérium-sejtszám, sôt a veszszôk apikális része már jelentôs mértékben mentes volt a látens fertôzéstôl. Szintén az Egyesült Államokban Chenin blanc, Pinot Chardonnay és Rizling fajták hajtásainak (internódium) agrobaktérium-tartalmát vizsgálták május és október között. Az internodiális szakaszokban augusztus elejéig a patogén nem volt detektálható, a baktérium csak augusztus végétôl jelent az új hajtásokban, szintén elsôsorban a vesszôk alsó részében. A baktérium felvándorlása az idôsebb fás részbôl a fiatal új hajtásokba feltételezhetôen a lignifikációt követôen a másodlagos xylem kialakulásával áll összefüggésben, mivel ez biztosítja a folyamatos fizikai kapcsolatot az idôsebb fás részek és az újonnan képzôdött hajtások között (Burr és mtsai 1988).
Magyarországon Cabernet sauvignon, Rajnai rizling, Irsai Olivér és Téli muskotály szôlôfajták tünetileg egészséges és golyvás tôkéirôl május végén és július elején gyûjtöttek be zöld hajtásokat. Fajtánként 10–10 hajtást vizsgáltak baktériumtartalomra a felsô hat és az alapi internódiumban mindkét idôpontban. A felsô hat apikális internódiumban sem május végén, sem július elején nem volt kimutatható az A. vitis jelenléte. Az alsó részben viszont júliusban már megjelent az agrobaktérium (Szegedi és Németh 1996). Ezek az eredmények megegyeznek Burr és mtsai (1988) megfigyeléseivel, és azt bizonyítják, hogy a vegetációs idôszak elsô felében a fiatal hajtások még mentesek a szisztemikus agrobaktérium-fertôzéstôl.
Erre további közvetett bizonyíték, hogy a vegetációs idôszakban a zöld hajtásokon sohasem figyelhetô meg tünet, pedig a hajtásválogatással, csonkázással okozott nagyszámú sérülés elvileg kedvezne a tumorok megjelenésének. A nyár eleji zöldmunkák idején viszont a fiatal, fogékony hajtásokban még nincs jelen a baktérium.
Ezekre a megfigyelésekre alapozva fiatal zöld hajtásokból nyert gyökeresített zöld dugványok felhasználásával vagy a zöldoltás alkalmazásával feltételezhetôen jelentôs mértékben csökkenteni lehetne az agrobaktériumos fertôzés szaporítóanyaggal való terjedését. A laboratóriumi hátteret igénylô és költségesebb in vitro technika mellett a szôlô zöld hajtásokról történô szaporítása alkalmas alternatív eljárás lehet agrobaktérium-mentes szaporítóanyag tömegeselôállítására. Annak ellenére, hogy a zöldsza- porítás módszere a hazai és nemzetközi gyakor- latban ismert (Baglyas 2003, Thomas és Schiefelbein 2004), széles körben sajnos még nem terjedt el.
In vitro szaporítás
Az így fölnevelt növények teljes mértékben mente- sek voltak agrobaktériumtól. Thies és Graves (1992) különbözô Vitis rotundifolia Michx. (muscadina szôlôfajták) genotípusok 0,2–0,4 mm-es hajtáscsúcs-merisztémáiból in vitro növényeket regenerált. Az így fölnevelt növények közül mintegy 200-at teszteltek agrobaktériumra, ezek mindegyike szintén mentes volt. Az in vitro módszerrel a Pierce-betegséget okozó Xyllela fastidiosa baktériumot is sikeresen eliminálták (Robacker és Chang 1992). Az Egyesült Államokban hajtáscsúcstenyészetekkel elôállított és felszaporított növényekbôl létrehoztak egy szôlôültetvényt olyan területen, ahol korábban sohasem volt szôlô. Az ültetvény, a hideg éghajlati viszonyok ellenére is, hét év után még mindig mentes volt a golyvától (Burr és mtsai 1998).
Köszönetnyilvánítás
A szerzôk köszönetüket fejezik ki a Földmûvelésügyi és Vidékfejlesztési Minisztérium (FVM) 151-a1/2002 számú, valamint az Országos Tudományos Kutatási Alap (OTKA) T042465 számú támogatásáért.
Patogénmentes szaporítóanyag elôállítására a hôkezeléskor és a zölddugványozáskor a labo- ratóriumi háttér szükségessége miatt költsége- sebb, de lényegesen megbízhatóbb módszer a szôlô in vitro szaporítása. A tenyészetek indítá- sa történhet hajtáscsúcsokból, vagy hajtáscsúcs- merisztémákból. A kiindulási anyagként hajtás- csúcsok ugyanis még mentesek a szisztemikus baktériumfertôzéstôl, és ezeket leoltás elôtt fe- lületileg is fertôtlenítik, ami további biztonsági tényezô. A növényi anyag esetleges fertôzöttsé- ge könnyen ellenôrizhetô, de ha elôfordul is, az a növények felszaporítása (átoltások) során a táptalajon általában megjelenik. Burr és mtsai (1988) Pinot Chardonnay szôlôfajta fertôzött és egészséges tôkéinek vesszôit üvegházban hajtatta, és a zöld hajtások mintegy két cm-es hajtáscsúcsaiból indított in vitro tenyészeteket.Forrás: Növényvédelem
