Az alternata és tenuissima fajcsoportokon belül, illetve között csak kismértékû polimorfizmust tártunk fel. Gazdanövények, illetve földrajzi eredet szerinti tagozódást nem tapasztaltunk.
Összességében a módszer alkalmas a fajcsoportok és fajok elkülönítésére, ami összhangban áll a morfológiai bélyegeken alapuló csoportosítással a hazai izolátumokra vonatkozóan is.
A kisspórás Alternaria-fajok A. alternata (syn: A. tenuis, Nees 1816) gyûjtônévvel vagy Alternaria spp.-vel történô jelölése a hazai gyakorlatban széleskörûen elterjedt. Foltosodás típusú megbetegedések kiváltójaként írták le a kórokozót. A gomba az egész világon elôfordul, szinte mindenféle környezetben megtalálható.
Szaprotrófként fellelhetô a talajban és a bomlásban lévô növényi maradványokon, patogénként pedig több mint 300 szántóföldi növényen és kertészeti kultúrán jelenik meg (Simmons 1992).
Az Alternaria nemzetség nagy diverzitásának köszönhetôen több munka ajánlása szerint a morfológiailag azonos bélyegeket viselô fajokat alcsoportokba sorolják (Ellis 1971, 1976, Joly 1964, Neergaard 1945). Hazánkban a Neergardféle rendszerezés terjedt el, mely a konídiumméreteket és a konídiumlánc-hosszúságot tekinti fô rendszerezô elvnek. E szempontból a kisspórásokhoz tartozó fajok két csoportba sorolhatók: a hosszúláncot (Longicatenae) és a közepesen hosszú láncot (Brevicatenae) képzôkre.
Számos Alternaria-faj, különösen a kisspórásokhoz tartozó A. tenuissima, A. infectoria, A. arborescens és A. brassicicola, morfológiailag nagyon hasonlít az A. alternatához. E hasonlóság az említett fajok pontos, morfológiai azonosíthatóságának nehézségeit veti fel. Simmons (1992) újrarendszerezte az Alternaria nemzetséget,
és bevezette a fajcsoport fogalmát. 14 csoportot különített el, melyek élére egy-egy típusfajt állított. E rendszerezés elveként továbbra is a konídiumtulajdonságok, a konídiumképzôdés és a csôr alakja szerepeltek. Késôbb Simmons és Roberts (1993) a konídiumláncok elágazása szerint a gaisen, az alternata, a tenuissima, az infectoria és az arborescens fajcsoportokat különítette el. Igaz, a fajcsoport megnevezéssel nem lehet pontos fajhatárokat húzni a nemzetségen belül, a morfológiailag rendkívül változatos Alternaria-fajokat mégis egyöntetû csoportokba lehet rendezni. Így egységesen lehet megvitatni az alaktanilag azonosnak tekintett fajokat, elkerülve a korábbi gyakorlatban problémát okozó, az alternáriák nevezéktanában elôforduló bizonytalanságokat.
Korábbi vizsgálataink során kisspórás Alternaria-izolátumok morfológiai bélyegeit, a konídiumok méreteit és konídiumlánc-képzését vizsgáltuk meg. Tapasztalatunk szerint önmagában a konídiumokra alapozva nem lehetett az egyes fajcsoportokat egyértelmûen azonosítani.
A konídiumlánc-szerkezet viszont olyan határozó bélyegként szolgált, mely alapján a fajcsoportok elkülöníthetônek bizonyultak (Dongó és Fischl 2004). Az újabb, gyakran molekuláris eszközök használata révén lehetôvé vált a Alternariafajok eredetének és diverzitásának pontosabb meghatározása, az azonosítás és jellemzés egzaktabb megfogalmazása. Az alkalmazott módszerek között megtalálható a RAPD- (random amplified polimorphic DNA), az rDNS-, valamint a kariotípus-elemzés (Jasalavich és mtsai 1995, Akamatsu és mtsai 1999, Pryor és Gilbertson 2000, Pryor és Michaliades 2002).
RAPD-módszert a különbözô fajcsoportok vizsgálatára, valamint közeli rokonságban álló fajok elkülönítésére használták (Cooke és mtsai 1998, Weir és mtsai 1998, Morris és mtsai 2000, Roberts és mtsai 2000, Pryor és Michaliades 2002). A módszerrel kimutatott diverzitás összhangban állt a morfológiai, fiziológiai és biokémiai tulajdonságokkal (Roberts és mtsai 1999).
Munkánk célja az volt, hogy Alternariaizolátumaink genetikai diverzitását tanulmányozva molekuláris (RAPD) módszerrel megvizsgáljuk, hogy a morfológiai alapokon korábban elkülönített hazai izolátumok (Dongó és Fischl 2004) valóban különálló fajcsoportok, nem pedig egy fajnak, az A. alternatának egyszerû változatai.
Anyag és módszer
DNS-kivonáshoz 100 ml burgonya-dextróz tápoldatot inokuláltunk 10 napos tenyészetek konídiumszuszpenziójával. A beoltott gombakultúrát 72 órán keresztül rázattuk (120 rpm) 22°C-on. A képzôdött micéliumot textilszûrôvel nyertük ki, majd liofilizáltuk és folyékony nitrogénben porítottuk. A teljes genomi DNS kivonását alapvetôen Murray és Thompson (1980) módszere szerint végeztük. Egy milliliter lizáló pufferben (0,7 M NaCl, 1% CTAB, 50 mM Tris pH 8,0, 250 mM EDTA pH 8,0) 60 mg micélimport tártunk fel 65 °C hômérsékleten.
A sejttörmeléket centrifugálással távolítottuk el, majd extrakciót végeztünk fenol-kloroformizoamil-alkohol (25:24:1) és kloroform-izoamil-alkohol (24:1) keverékével. A DNS-t egy térfogat B oldattal (1% CTAB, 50 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0) kicsapattuk. A pelletet lízis puffer és B oldat 1:1 arányú keverékével mostuk, majd C oldatban (10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA pH 8,0, 1 M NaCl) feloldottuk, melybôl a DNS-t izopropanollal csaptuk ki, majd mostuk 70%-os etanolban, végül 200 µl TE (10 mM Tris és 1 mM EDTA pH 8,0) pufferben oldottuk. Ezt az anyagot kezeltük ribonukleázzal (RNáz A, Fermentas, 1 Kunitz unit/minta) és proteinázzal (Proteináz-K, Fermentas, 50 µg/minta).
Újabb szerves oldószeres extrakció és alkoholos kicsapatás után 30 µl TE-ben oldottuk fel a DNS-t. A minták koncentrációját spektrofotometriásan határoztuk meg (Perkin Elmer UV/VIS Spectrometer Lambda 2S).
A teljes genomi DNS-ek polimeráz-láncreakción (PCR) alapuló felszaporításához OPR-02 (5’-CACAGCTGCC), OPR-12 (5’-ACAGGTGCGT) és OPA-04 (5’-AATCGGGCT) indítószekvenciákat (primereket) használtunk.
Ezek közül az OPR-02-t és az OPR-12-t Roberts és mtsai (2000), az OPA-04 Pryor és Michaliades (2002) vizsgálataiban már alkalmazták mint a kisspórás alternáriák elkülönítésére használható szekvenciákat.
A 25 µl végtérfogatú PCR-elegy összetétele a következô volt: 100 ng templát DNS, 1,5 mM MgCl2, 200 µM dNTP oldat, 1 egység Taq DNS polimeráz (Fermentas), 1× Fermentas Taq Buffer + (NH4)2SO4, 0,4 µmol indítószekvencia, valamint az össztérfogat eléréséhez szükséges steril milliQ víz. Negatív kontrollt is készítettünk, DNS felhasználása nélkül. Egy indítószekvenciával az összes mintában egyszerre végeztettük a DNS-sokszorosítást PTC-150 típusú (Perkin-Elmer) készülékkel a következô program szerint: kezdô denaturáció (94 °Con 3 percig), 36 ciklus (94 °C-on 1 percig, 36 °C-on 1 percig, 72 °C-on 2 percig), záró inkubálás (72°C-on 10 percig). Egyenként 8µl PCR termékkel végeztünk elektroforézist 20 cm hosszú, 1,5%-os agarózgélben (Gibco), 0,5×TBE pufferben, 130 V-on, 4 órán keresztül. A mintázatot 0,5 μg ml-1 etídium-bromiddal festettük és UV megvilágításban fényképeztük (Chemilmager 4000 UV Light Imaging System – i 3.3b Alpha Innotech Corporation, San Leandro, USA).
A RAPD-mintázatot oly módon értékeltük, hogy az egyes sávok méretét meghatároztuk, s minden egyes izolátumban 1, illetve 0 értékkel jelöltük a sávok meglétét vagy hiányát. Az adatokat mátrixba csoportosítottuk, s a mátrixból egyezési koefficienst (simple matching coefficient) figyelembe véve csoportátlag (unweighed pair-group method using arithmethic averages: UPGMA) módszerrel dendrogramot készítettünk, felhasználva a Syn-Tax 2000 programcsomag hierarchikus klaszterezô alprogramját (Podani 2001).
Eredmények és megvitatásuk
A fajcsoportokra jellemzô reprezentatív mintázatokat az 1. ábrán tüntettük fel. Az OPR-12-es indítószekvenciával kapott RAPD-mintázatot különbözô A. tenuissima-, A. alternata-, A. arborescens-, A. brassicicola- és A. infectoria-izolátumok bemutatásával szemléltetjük. Az egyes fajokra jellemzô mintázatok specifikusságot tükröznek. Oligonukleotidonként 40–45, azaz összesen 122 markert azonosítottunk és értékeltünk.
A legtöbb fragmentum nagysága 300 és 3000 bp között változott. Megjegyezzük, hogy csak azokat a sávokat fogadtuk el RAPD-markernek, melyek következetesen elegendô intenzitással festôdtek. Az egyes indítószekvenciákkal létrehozott mintázatok jól elkülöníthetôek, a fajcsoportokra jellemzôek, s mindhárom primer külön-külön is alkalmas arra, hogy értékelhetô különbségeket állapítsunk meg a vizsgált kisspórás fajcsoportok között. A kapott mintázatok harmonizálnak az egyes fajcsoportokra jellemzô, szakirodalomban megjelent RAPD-mintázatokkal. A 92 izolátumra kapott adatok számítógépes feldolgozásának eredményét dendogram formájában közöljük (2. ábra), mely alapján a következôket állapítottuk meg. A tenuissima és alternata izolátumok nagy számarányuk ellenére egy közös, kevésbé polimorf csoportot képeztek.
RAPD-mintázataik jól elkülönültek más csoportokétól, s mindhárom primerrel két alcsoportot tudtunk elkülöníteni, melyek megfeleltek az alternata és tenuissima fajcsoportoknak.
A közöttük fennálló nagyfokú rokonság a hasonló mintázataik alapján is jól látható volt (1. ábra). Az alternata csoportban két atipikus mintázatú törzset figyeltünk meg. Egyiküket retekrôl (82), a másikat pedig muskátliról (150) izoláltuk. A konídiumlánc struktúráját megvizsgálva azt tapasztaltuk, hogy a 82-es izolátum alternatára jellemzô, a 150-es izolátum ettôl helyenként eltérô láncképzést mutat. A két izolátum összesített RAPD-mintázata alapján megállapítottuk, hogy mindössze 10%-ban különült el az alternata és a tenuissima fajcsoportoktól, melyektôl a még hozzájuk legközelebb álló arborescens fajcsoport is lényegesen nagyobb mértékben különbözött. Ezért a rendelkezésre álló adatok alapján azt feltételezzük, hogy az említett két atipikus izolátum az alternata csoportba tartozik. Gazdanövények, illetve földrajzi eredet szerinti tagozódást nem tapasztaltunk.
Roberts és mtsai (2000) valamint Pryor és Michaliades (2002) szerint az arborescens izolátumok két alcsoportra különíthetôk el RAPD-mintázataik alapján. Saját vizsgálatainkkal ezt nem tudtuk egyértelmûen alátámasztani.
Feltehetôen azért, mert viszonylag kevés törzs állt rendelkezésünkre, jóllehet egy izolátum (131) meglehetôsen távol került a többi arborescenstôl. Az infectoria fajcsoport tagjai alkották a legheterogénebb klasztert. Ez azért nem meglepô, mert közöttük olyan formálisan leírt fajok szerepelnek, melyek morfológiailag meglehetôsen eltérnek, csupán azonos módon képezik konídiumláncaikat (Simmons 1994).
Érdekesség, hogy a spóraláncot az alternatákkal azonos módon képezô brassicicola izolátumok egymástól igen távolra kerültek a dendogramon. Ez pedig arra utal, hogy a sporuláció típusa mint egyik igen lényeges morfológiai határozóbélyeg alapján nem minden esetben lehet a fajcsoportokat azonosítani. Mivel azonban az alternata és brassicicola fajcsoportok között jól kimutatható egyéb morfológiai különbségek is vannak, jelenlegi elhelyezkedésük a dendogramon mégsem meglepô. A brassicicola izolátumok kismértékû polimorfizmusa valószínûleg szintén a viszonylag kevés izolátumszámra vezethetô vissza.
A fentiekbôl látható, hogy a hazánkban is széleskörûen elterjedt, a kisspórás Alternariafajokat pontatlanul azonosító A. alternata fajmegjelölés valójában milyen fajcsoportokat takar.
Így a kisspórás izolátumok korrekt megnevezése céljából, a Simmons-szerinti fajcsoport szintû azonosítás mindenképpen javasolt, szemben a Neergard-féle csoportosítással.
Összességében a RAPD-módszer alkalmasnak bizonyult a hazai Alternaria-fajcsoportok és fajok elkülönítésére. Eredményeink összhangban állnak a morfológiai jellegek alapján kapott adatokkal. Hosszú távon a klasszikus és a molekuláris taxonómia megfelelô szintéziséhez további interspecifikus és intraspecifikus különbségeket
szolgáltató molekuláris markereket szükséges alkalmazni. Ezeket akár önállóan, akár együttesen használva jutunk majd olyan megfelelô adatokhoz, melyek e konídiumos gombák rendszerezésének teljes értelmezéséhez vezet.
Köszönetnyilvánítás
A szerzôk köszönetet mondanak B. M. Pryornak, B. Andersennek és P. Simoneau-nak a referenciaizolátumok rendelkezésükre bocsátásáért.
Dongó Anita köszönetét fejezi ki a MTA Növényvédelmi Kutatóintézete Növénykórtani Osztályának a vizsgálatok elvégzéséhez szükséges eszközök biztosításáért.
Dongó Anita, Fischl Géza
(VE Georgikon Mezôgazdaságtudományi Kar, Növénykórtani és Növényvirológiai Tanszék, 8360 Keszthely, Deák Ferenc u. 57.)
Bakonyi József
(MTA Növényvédelmi Kutatóintézete, 1022 Budapest, Herman Ottó út 15.)
Növényvédelem 11 (41), 2005
Forrás: Növényvédelem
